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Title: 从秦艽来源的环烯醚萜前体环烯醚三醛合成环烯醚萜及裂环环烯醚萜类结构类型的杂萜化合物研究
秦艽中萜类合酶及环烯醚萜生物合成关键酶基因的鉴定与表达分析
萜类合酶（TPS）是萜类化合物生物合成的关键酶[1]。通过Pfam结构域模型PF03936和PF01397搜索秦艽（G. macrophylla）基因组，共鉴定出39个候选TPS基因[1]。结合拟南芥（A. thaliana）、咖啡树（C. canephora）、毛果杨（P. trichocarpa）和水稻（O. sativa）的TPS基因构建系统发育树后，秦艽TPS基因可分为6个亚家族，其中TPS-a亚家族基因数量最多（26个），且在2号和8号染色体上存在串联重复（分别为9个和12个基因），推测串联重复是秦艽TPS基因家族扩张的主要原因[1]。基因表达分析显示，多数同一亚家族的TPS基因表达模式相似，如TPS-a基因主要在叶片中表达、TPS-g基因在茎中表达水平较高，这可能导致秦艽不同组织中萜类物质合成的特异性[1]。
环烯醚萜作为秦艽中的重要萜类化合物，其生物合成前体香叶基二磷酸（GPP）来源于细胞质的甲羟戊酸（MVA）途径和质体的2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）途径[1]。基于基因组注释，秦艽中MVA和MEP途径的所有关键酶基因均被鉴定，其中MEP途径的DXR、CMK、MDS基因和MVA途径的MVD基因为单拷贝，其余基因家族存在2-8个拷贝的扩张[1]；表达分析表明，多数MVA途径酶基因在花中高表达，而MEP途径酶基因在叶片中高表达[1]。
环烯醚萜生物合成途径的关键酶基因（如GES、G10H、8-HGO、IS、NEPS、IO、7-DLGT、7-DLNGT、7-DLH、LAMT、SLS、STR）在秦艽中均有不同拷贝数[1]。与其他环烯醚萜产生物种（如O. pumila、C. acuminata）相比，秦艽15个环烯醚萜相关基因的拷贝数更高[1]；除GES外，环烯醚萜生物合成途径的所有结构基因家族均发生扩张，且G10H、8-HGO、NEPS、7-DLGT、7-DLH、LAMT、SLS、STR等基因在染色体上存在串联重复[1]。不同组织的表达分析鉴定出40个差异表达的环烯醚萜相关基因（包括GES、7个G10H、7个8-HGO、2个IS、1个NEPS、2个IO、6个7-DLNGT、4个7-DLGT、3个DLH、2个SLS、5个STR），其中19个在叶片中高表达、13个在花中高表达，这可能是秦艽不同组织中环烯醚萜衍生物含量差异的原因[1]。
秦艽转录组与代谢组关联分析及其环烯醚萜含量的组织特异性分布
秦艽（G. macrophylla）转录组分析显示，共2170个unigenes参与128条标准KEGG次生代谢通路，其中92个unigenes参与萜类骨架生物合成[2]。作为特殊萜类，环烯醚萜由香叶基焦磷酸经复杂过程合成，共有102个unigenes注释到该通路的25种酶，且多数酶基因在叶和花中表达量较高[2]。为验证转录组数据，通过qRT-PCR检测了环烯醚萜通路6个关键酶基因在4个组织中的表达，其趋势与转录组分析一致[2]；代谢组分析（UPLC-Q-Exactive MS）从各组织中鉴定出22种化合物（含10种环烯醚萜），多数环烯醚萜在根中含量丰富[2]。关键酶基因表达与环烯醚萜含量的关联分析显示：GPPS和HDR聚为一类，与secologanoside含量高度相关；7-DLH和SLS的表达与多数环烯醚萜显著相关；7-DLGT和G8O与loganic acid 11-O-β-葡萄糖苷酯及Gentimacroside含量的相关性更强[2]。
环烯醚萜通路关键酶基因的组织表达特征
| 关键酶基因 | 表达量最高组织 | 表达量最低组织 |
|---|---|---|
| HDR | 叶 | 根 |
| GPPS | 叶 | 根 |
| 7-DLGT | 根 | 茎 |
| G8O | 根 | 茎 |
| 7-DLH | 花 | 叶 |
| SLS | 花 | 叶 |
秦艽不同组织中环烯醚萜的分布特征
| 环烯醚萜化合物 | 茎中检出情况 | 花中检出情况 | 叶中检出情况 |
|---|---|---|---|
| loganic acid 11-O-β-葡萄糖苷酯 | 未检出 | 未检出 | - |
| morroniside | - | - | 未检出 |
| swertiapunimarin | - | - | 未检出 |
栀子细胞培养中京尼平的生物转化及UGT85A24酶的功能特性
栀子细胞培养体系中，添加的京尼平可经生物转化生成京尼平苷和栀子苷，且该转化产物已通过核磁共振（NMR）鉴定确认[3]。为解析转化过程的分子机制，研究从栀子中分离得到13个编码植物次生代谢产物糖基转移酶（PSPG）保守域的cDNA克隆（GjUGT1–GjUGT13），其中仅GjUGT2（即UGT85A24）具有催化京尼平糖基化生成京尼平苷的功能[3]。
UGT85A24的酶学特性与表达特征
| 分析类别 | 具体指标 | 结果 | 参考文献 |
|---|---|---|---|
| 底物特异性 | 7-脱氧马钱素、京尼平、马钱素、7-脱氧马钱酸、非环烯醚萜类 | 对7-脱氧马钱素和京尼平活性较强，马钱素活性较弱，其余底物无活性 | [3] |
| 糖供体特异性 | UDP-葡萄糖及其他潜在糖供体 | 仅以UDP-葡萄糖为糖供体 | [3] |
| 动力学参数 | 7-脱氧马钱素与京尼平的Km值、kcat/Km值 | 7-脱氧马钱素Km值（0.61 mM）低于京尼平（8.82 mM）；kcat/Km值为京尼平的2倍 | [3] |
| 茉莉酸甲酯处理 | 京尼平糖基化活性、UGT85A24的mRNA水平 | 二者呈相关性上调 | [3] |
| 组织表达 | 各器官mRNA分布、果实发育过程中mRNA表达量变化 | 除茎外所有器官均有检测；果实发育早期表达量上升，随后下降 | [3] |
| 成分相关性 | 京尼平苷与栀子苷的器官分布、环烯醚萜类成分含量与mRNA水平的相关性 | 京尼平苷主导果实，栀子苷主导其他器官；成熟果实中相关性除外 | [3] |
此外，转化产物的积累动态显示：京尼平苷形成迅速，在8小时达到峰值后逐渐下降；栀子苷则在72小时内呈缓慢上升趋势[3]。
木犀科植物裂环环烯醚萜的生物合成路径及关键前体与酶的作用
木犀科植物裂环环烯醚萜的生物合成路径研究表明，其合成起始于香叶醇和10-羟基香叶醇，二者经转化生成环烯醚三醛类前体物质环烯醚二醛（iridodial），该过程在丁香属（Syringa）和梣属（Fraxinus）植物的饲喂实验中得到验证[4]。环烯醚二醛进一步参与油橄榄苷型裂环环烯醚萜的生物合成[4]。后续代谢步骤中涉及的关键酶与底物关系及相关假说如下表所示：
裂环环烯醚萜生物合成中的关键酶与底物关系
| 代谢反应涉及的物质 | 推测/已鉴定的催化酶及依据 | 相关假说或争议点 | 文献来源 |
|---|---|---|---|
| 7-酮马钱苷→油橄榄苷-11-甲酯 | 推测与次马钱苷合酶（细胞色素P450酶）序列相似，因其反应机制与马钱苷→次马钱苷转化相似 | 马钱苷和次马钱苷作为油橄榄裂环环烯醚萜中间产物的可能性存在争议，但支持次马钱苷合酶的参与 | [4] |
| 7-酮马钱酸（与7-酮马钱苷为差向异构体） | 推测由马钱酸O-甲基转移酶（LAMT）相似酶催化，依据为长春花CrLAMT对马钱酸的高特异性，已鉴定出油橄榄同源物OeLAMT | - | [4] |
| 脱氧马钱苷元、油橄榄苷-11-甲酯、油橄榄苦苷元 | 糖基转移酶（GTs），具体催化葡萄糖基转移形成脱氧马钱酸、7-β-D-吡喃葡萄糖基-11-甲基油橄榄苷，以及油橄榄苦苷（路径最后一步） | - | [4] |
| 3,4-二羟基苯乙醇-EDA（3,4-DHPEA-EDA）→油橄榄苦苷 | 油橄榄高酚品种Coratina中OeGT等基因高表达 | 支持3,4-DHPEA-EDA作为油橄榄苦苷前体的假说；Dolce d’Andria品种早期仅检测到该物质，提示下游通路阻断抑制其他裂环环烯醚萜形成 | [4] |
此外，糖基转移酶（GTs）在裂环环烯醚萜的生物合成中发挥关键作用，其催化的多个糖基化步骤覆盖了路径中的重要节点[4]。
References
[1] Zhou T, Bai G, Hu Y, Ruhsam M, Yang Y, Zhao Y., De novo genome assembly of the medicinal plant Gentiana macrophylla provides insights into the genomic evolution and biosynthesis of iridoids, 2022, DNA Res
[2] Kou Y, Yi X, Li Z, Ai Y, Ma S, Chen Q., A Comparative Transcriptomic with UPLC-Q-Exactive MS Reveals Differences in Gene Expression and Components of Iridoid Biosynthesis in Various Parts of Gentiana macrophylla, 2022, Genes (Basel)
[3] Nagatoshi, M.; Matera, K.; Nagatsu, A.; Mizukami, H., Iridoid-specific Glucosyltransferase from Gardenia jasminoides, 2011, Journal of Biological Chemistry
[4] Alagna, Fiammetta; Mariotti, Roberto; Panara, Francesco; Caporali, Silvia; Urbani, Stefania; Veneziani, Gianluca; Esposto, Sonia; Taticchi, Agnese; Rosati, Adolfo; Rao, Rosa; Perrotta, Gaetano; Servili, Maurizio; Baldoni, Luciana, Olive phenolic compounds: metabolic and transcriptional profiling during fruit development, 2012, BMC PLANT BIOLOGY